一种新颖乳酸菌株、含有其的抑菌组合物及其用途,包括:一种新颖乳酸戊糖片球菌株(Pediococcus pentosaceus),或该菌株的继代培养后代;该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.5235,该菌株可以抑制发光杆菌(或称巴斯德杆菌)(Photobacterium damselae)等病原菌的生长;以及包含该乳酸菌PP49菌株的组合物,该组合物为动物饲料添加剂或动物用医疗组合物等形式。
1.一种乳酸菌株,所述菌株为一种乳酸戊糖片球菌株(Pediococcusxa0pentosaceus),其为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCCxa0No.5235的菌株,或所述保藏菌株的继代培养后代。
2.一种包含如权利要求1所述的乳酸菌株的组合物。
3.如权利要求2所述的组合物,其中所述组合物包含动物饲料添加剂或动物用医疗组合物。
4.如权利要求3所述的组合物,其中所述动物为鱼类。
5.一种如权利要求2所述的组合物在制备用于抑制发光杆菌(Photobacteriumxa0damselae)的生长的药物中的应用。
6.一种乳酸菌株在制备保护鱼类免于感染发光杆菌的药物中的应用,包含:对鱼类施予有效量的如权利要求1所述的乳酸菌株及发光杆菌疫苗。
7.如权利要求6所述的应用,所述乳酸菌株可进一步混合于饲料或动物用医疗组合物中喂食鱼类,并搭配所述发光杆菌疫苗接种。技术领域
本发明涉及一种新颖乳酸菌株,特别是指一种可以降低发光杆菌(Photobacteriumxa0damselae)生长且可提升海鲡对发光杆菌抵抗力的乳酸菌株,以及含有该乳酸菌株的组合物及该组合物的用途。xa0
背景技术
随着全球人口的增加,人类对于粮食的需求也与日俱增;在捕鱼业渔获量日渐减少的情况下,养殖渔业成为重要的肉品供应来源之一。海鲡(Rachycentronxa0canadum)是一种热带海洋鱼类,也是海鲡科(Rachycentridae)唯一的鱼种。因为海鲡对环境的高忍受度以及其快速的生长率,海鲡成为理想的海水箱网养殖鱼种。台湾海鲡养殖业始于1990年代初期;于1997年人工育种成功后,此高经济价值的鱼种便广泛地被养殖于海水箱网中(Liaoxa0etxa0al.,2004)。xa0尽管海鲡产量逐年增加,但包括发光杆菌(或称巴斯德杆菌)(Photobacteriumxa0damselaexa0subsp.piscicida,Pdp)与弧菌(Vibrio)等的细菌性病原菌已对海鲡鱼苗造成严重的疫情。其中发光杆菌Pdp对海鲡造成的威胁最严重,死亡率也最高。发光杆菌Pdp为革兰氏阴性菌,会造成感染鱼的内脏产生白色的结节,并且由受感染的吞噬细胞散布传染。到目前为止,海鲡养殖业者对抗发光杆菌Pdp最主要的方法是使用抗生素;然而,发现有越来越多对抗生素产生抗性的发光杆菌,而且使用抗生素也会有药物残留等食品安全的问题。另一方面,由于海鲡的免疫记忆力(immunexa0memory)不像许多其它的鱼种(如:石斑鱼)那么有效,因此对海鲡接种发光杆菌疫苗的效果并不稳定。xa0由此可见,上述常规针对海鲡抵抗发光杆菌感染的方法仍有诸多不足,并非权宜之计,而亟待加以改良。xa0在许多研究中,乳酸菌(lacticxa0acidxa0bacteria,LAB)已被使用作为益生菌(probiotics)。乳酸菌产生的有机酸与细菌素(bacteriocin)能够抑制或直接杀死许多微生物(Ercolanixa0etxa0al.,1976;Mathurxa0etxa0al.,2005),且乳酸菌抗酸及抗胆汁的能力可以提高该菌在动物肠胃道的存活率(Iriantoxa0etxa0al.,2002)。此外,前人研究显示,约有1%至10%的肠道细菌具有成为益生菌的潜力(Sugitaxa0etxa0al.,2002)。xa0因此,本申请发明人鉴于上述常规针对海鲡抵抗发光杆菌感染的方法所衍生的各种缺点,以及乳酸菌作为益生菌的可能性,亟思加以改良创新,并经多年苦心孤诣潜心研究后,终于成功研发完成本申请的新颖乳酸菌株、含有其的组合物及其用途。xa0
发明内容
本说明书中所述的所有技术性及科学术语,除非另外有所定义,均为本领域普通技术人员可共同了解的意义。xa0本发明的目的在于提供一种新颖乳酸菌株-乳酸戊糖片球菌(Pediococcusxa0pentosaceus),该菌株筛选自饥饿三天后海鲡的肠道。xa0本发明的再一个目的在于提供一种含有新颖乳酸菌株-乳酸戊糖片球菌(Pediococcusxa0pentosaceus)的组合物,该组合物具有抑制发光杆菌(Photobacteriumxa0damselae)等病原菌生长,以及提升海鲡免疫力的效果。xa0本发明的另一个目的在于提供一种含有新颖乳酸菌株-乳酸戊糖片球菌(Pediococcusxa0pentosaceus)的组合物的应用,所述组合物可作为鱼饲料、鱼疫苗的添加剂,以增进鱼类抵抗发光杆菌等病原菌的能力。xa0可达成上述发明目的的新颖乳酸菌株、含有其的组合物及其用途,包括:一种新颖乳酸戊糖片球菌株(Pediococcusxa0pentosaceus),或所述菌株的继代培养后代;所述菌株筛选自海鲡肠道样品,并经过耐酸性、耐胆盐性筛选,以及喂食海鲡后进行攻毒试验所得到可以帮助海鲡抵抗发光杆菌Pdp感染的乳酸菌株。xa0所述新颖乳酸戊糖片球菌株(P.pentosaceus)已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCCxa0No.5235的菌株,保藏日期为2011年9月9日。xa0将本发明所筛选的乳酸戊糖片球菌(P.pentosaceus)PP49菌株培养悬浮液与发光杆菌Pdp一起培养,结果显示,本发明的新颖乳酸戊糖片球菌PP49菌株可以抑制病原菌发光杆菌Pdp的生长。xa0将本发明的乳酸戊糖片球菌(P.pentosaceus)PP49菌株与市售鱼饲料混合以喂食海鲡,结果显示本发明乳酸戊糖片球菌(P.pentosaceus)PP49菌株可明显促进海鲡生长率;搭配接种发光杆菌疫苗后,可以增加海鲡对发光杆菌Pdp感染的抵抗力,其相对存活率显著高于只有接种疫苗的鱼以及对照组。xa0本发明进一步提供含有本发明的乳酸戊糖片球菌(P.pentosaceus)PP49菌株的组合物,所述组合物用于抑制发光杆菌Pdp的生长;所述组合物可制成动物饲料添加剂或动物用医疗组合物等形式。xa0其中所述组合物可进一步包含药学上可接受的载体,所述载体包含但不限于:溶剂(solvent)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspendingxa0agent)、分解剂(decomposer)、黏结剂(bindingxa0agent)、赋形剂(excipient)、稳定剂(stabilizingxa0agent)、螯合剂(chelatingxa0agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingxa0agent)、防腐剂(preservative)、润滑剂(lubricant)、表面活性剂(surfactant)、佐剂(adjuvant),及其它类似或适用本发明的载体。xa0本发明还提供增强鱼类对抗发光杆菌的免疫力的方法,包含:对鱼类施予有效量的乳酸戊糖片球菌(P.pentosaceus)PP49菌株、或含有其的组合物及发光杆菌疫苗,即可增强其对抗发光杆菌的免疫力;其中所述乳酸戊糖片球菌(P.pentosaceus)PP49菌株可进一步混合于饲料或动物用医疗组合物中喂食鱼类,并搭配该发光杆菌疫苗接种,以提高其对抗发光杆菌的免疫力。xa0另外,本发明亦提供前述乳酸戊糖片球菌(P.pentosaceus)PP49菌xa0株用于制备保护鱼类免于感染发光杆菌的药物的方法或用途。xa0本发明所述的新颖乳酸戊糖片球菌(P.pentosaceus)PP49菌株,亦应包含其继代培养的后代或突变株,但仍具有与本发明所述的菌种相同的特性、基因体(genomic)或功能性。xa0术语“有效量”是指对于个体的用量,该用量可有效增进、改善该个体的免疫力以对抗发光杆菌,进而预防及保护该个体免于感染发光杆菌及其衍生的相关疾病。xa0术语“预防、保护”是指相较于未使用本发明的疫苗者,使用本发明的疫苗者将可有效增强其免疫力以对抗发光杆菌,增加其存活率,进而预防及保护其免于发光杆菌引起的疾病及其衍生的相关疾病。xa0
附图说明
图1为海鲡肠道乳酸菌株抑制发光杆菌Pdp生长的曲线图;取乳酸戊糖片球菌(P.pentosaceus)菌株PP49培养悬浮液加入发光杆菌Pdp生长培养基中培养该菌,并观察发光杆菌Pdp的生长量;阴性对照组以BHI液体培养基混合MRS液体培养基(pH值为6.2)培养发光杆菌Pdp,而阳性对照组则是以BHI液体培养基混合调整过pH值的MRS液体培养基(pH值为5)培养发光杆菌Pdp;吸光值OD₆₀₀代表发光杆菌Pdp的生长量。xa0图2为比较喂食乳酸菌株(PP49)14天后的试验组海鲡与对照组海鲡的体重,图2A为海鲡体重分析图;图2B为海鲡生长速率分析图。xa0图3为比较喂食乳酸菌株PP49(乳酸菌喂食试验组)海鲡与未喂食乳酸菌(对照组)海鲡的吞噬细胞分解病原体的能力分析图;吸光值OD₅₉₅代表吞噬细胞分解病原体的能力。xa0图4为针对喂食乳酸菌株PP49(乳酸菌喂食试验组)海鲡与未喂食乳酸菌(对照组)海鲡,进行发光杆菌Pdp攻毒试验的结果分析图。xa0图5为针对接种发光杆菌疫苗的海鲡,进行发光杆菌Pdp攻毒试验的结果分析图;两组试验组鱼均接种发光杆菌疫苗,其中一组试验组xa0同时配合喂食乳酸菌株PP49(疫苗接种及乳酸菌喂食组),另一组试验组则只喂食市售鱼饲料(仅疫苗接种组);对照组则未接种疫苗,并且只喂食市售鱼饲料。xa0
具体实施方式
本发明通过下面的实施例进行示范阐明,但本发明不受下述实施例的限制。xa0实施例一海鲡肠道乳酸菌株的筛选与分离xa01.海鲡肠道乳酸菌筛选xa0收集饥饿三天后的海鲡肠道样品,于乳酸菌筛选用MRS培养基(Flukaxa069966)中,在37°C厌氧环境下培养(Dexa0Manxa0etxa0al.,1960)。将分离出的乳酸菌在体外初步完成耐酸性及耐胆盐测试,以及吸附性试验后,选出三株乳酸菌株。其中,代号为strainxa0PP49的乳酸菌株对胃酸与胆盐的耐受度最高,因此被挑选作为喂食海鲡的试验材料。xa02.以16Sxa0rDNA测序鉴定海鲡肠道乳酸菌株xa0以16Sxa0rDNA测序对所筛选出的乳酸菌进行菌种鉴定,以下列引物对进行PCR反应(Weisburgxa0etxa0a1.,1991)。xa0正向引物:xa05’-agagtttgatcatggctcag-3’xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0(SEQxa0IDxa0No.:1)xa0反向引物:xa05’-aaggaggtgatccagcc-3’xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0(SEQxa0IDxa0No.:2)xa0以PCRxa0Systemxa02700(Appliedxa0Biosystems公司)进行PCR反应,PCR产物以ABIxa03730(Appliedxa0Biosystems公司)进行测序,接着以NCBI网站上BLAST功能进行序列比对,根据比对结果,PP49菌株属于乳酸戊糖片球菌(Pediococcusxa0pentosaceus)。xa0实施例二海鲡肠道乳酸菌株抗发光杆菌Pdp的效果xa01.乳酸菌株PP49抑制发光杆菌Pdp的生长xa0取实施例一分离得到的乳酸菌株PP49的代谢产物来测试抑制发xa0光杆菌Pdp的效果。发光杆菌Pdp菌株P40由澎湖大学古镇钧教授提供,于37°C下,以MRS液体培养基培养至吸光值OD₆₀₀为2,然后以5,000×g离心15分钟后,收集上清液(pH值为5)。将收集的上清液加入BHI液体培养基中(Becton,Dickinsonxa0andxa0Company),BHI培养基与上清液的混合比例为4:1,并纪录发光杆菌Pdp在该混合培养基内的生长曲线。阴性对照组以BHI液体培养基混合MRS液体培养基(pH值为6.2)培养发光杆菌Pdp,而阳性对照组则是以BHI液体培养基混合调整过pH值的MRS液体培养基(pH值为5)来培养发光杆菌Pdp;两个对照组的培养基混合比例均为4:1。在本试验中,分别将0.1ml的发光杆菌Pdp菌液(吸光值OD₆₀₀为1)加入到5ml各组培养基中,于28°C下培养,并以吸光值OD₆₀₀测量发光杆菌Pdp的生长曲线。xa0发光杆菌Pdp的生长曲线如图1所示。添加乳酸菌株PP49培养上清液的Pdp生长曲线远低于没有添加乳酸菌培养上清液的两个阴性对照组。xa0实施例三乳酸戊糖片球菌(P.pentosaceus)菌株PP49喂食海鲡后对海鲡免疫力提升的效果分析xa0随机将鱼(体重为4.6g)分为喂食乳酸菌组与对照组,每组含有17只鱼。乳酸菌喂食剂量为10⁹CFU/g,每日喂食量为鱼体重的5%,共喂食2周。喂食期间结束后,每组选出2只鱼采血进行分析;接着进行攻毒试验。xa0喂食期间过后,所有的鱼都以浸泡方式进行攻毒试验,于20°C下将鱼浸泡在含有2×10⁴CFU/ml发光杆菌的海水中2分钟。收集死亡鱼并分离肾脏与脾脏中的微生物样本以确认死因,并计算攻毒后10天内鱼的累积死亡率。xa01.海鲡体重增长率的分析xa0比较喂食乳酸菌14天后的试验组海鲡与对照组海鲡的体重,结果如图2所示。喂食乳酸菌PP49的海鲡体重有明显增长,该结果显示,xa0喂食乳酸菌株PP49可以提高鱼12%的生长率。xa02.海鲡吞噬细胞分解病原体能力的分析xa0根据Choudhury等人于2005年提出的方法,以硝基蓝四氮唑(nitrobluexa0tetraxolium,NBT)分析法测定血液中吞噬细胞分解病原菌的能力,又称为呼吸爆(respiratoryxa0burst,RB)。简言之,取96孔盘,每孔加入50μl血液样本,并于37°C下培养1小时,使吞噬细胞贴附于盘上。接着,去除上清液,并以PBS清洗三次后,加入50μlxa02%硝基蓝四氮唑(NBT),于37°C下再培养1小时。之后加入50μlxa0100%甲醇作用3分钟,并以30%甲醇清洗三次。待96孔盘风干后,每孔加入60μlxa02N氢氧化钾(potassiumxa0hydroxide)以及70μl二甲基亚砜(dimethylxa0sulphoxide,DMSO),待所有试剂反应后,以盘式酵素免疫分析仪(ELISAxa0reader,MRXxa0II,Dynexxa0Technologies公司)读取吸光值OD₄₉₀的读值。xa0海鲡吞噬细胞分解病原体能力的分析结果如图3所示。结果显示喂食乳酸菌的海鲡吞噬细胞分解病原体的能力明显高于对照组(p<0.05)。xa03.攻毒试验结果xa0进行攻毒试验后,海鲡的死亡率如图4所示。喂食乳酸菌(试验组)的海鲡相对存活率(RPS)为74.3。所有死亡的鱼确定死因均为感染发光杆菌Pdp所引起,喂食较对照组高出60%。xa0实施例四接种Pdp死毒疫苗配合喂食乳酸戊糖片球菌(P.pentosaceus)菌株PP49对海鲡免疫力提升的效果分析xa0随机将鱼(体重为35g)分为3组(接种疫苗组、接种疫苗加喂食乳酸菌组、无接种疫苗无喂食乳酸菌的对照组)。每组含有12只鱼。所有的试验均重复三次,攻毒试验方式与实施例三相同,但攻毒剂量改为1.5×10⁵CFU/ml。xa0除了对照组鱼外,所有鱼于试验开始时均进行Pdp死毒疫苗初次免疫(primaryxa0vaccination),并于三周后进行第二次追加免疫。初次免xa0疫及追加免疫的免疫剂量为0.333mg发光杆菌Pdp/鱼体重(g)。xa0攻毒试验结果如图5所示,只接种疫苗没有喂食乳酸菌株PP49的海鲡,其相对存活率(RPS)为59;配合喂食乳酸菌株PP49与接种疫苗的海鲡死亡率最低(如图5所示),则存活率(RPS)提高为95.5。xa0本发明所提供的新颖乳酸菌株(Pediococcuspentosaceus)、含有其的组合物及其用途,与其它常规技术相互比较时,具有下列的优点:xa01.本发明所提供的乳酸戊糖片球菌株PP49(P.pentosaceusxa0strainxa0PP49)分离自海鲡肠道,该菌具有耐酸性及耐胆盐等特性,制成口服剂型喂食鱼后,可存活在鱼肠胃道内。xa02.喂食本发明所提供的乳酸戊糖片球菌株PP49(P.pentosaceusxa0strainxa0PP49)的鱼,在同一生长时间内,其体重较未喂食该菌株的鱼重;可见本发明的菌株可增加鱼的生长率。xa03.本发明所提供的乳酸戊糖片球菌株PP49(P.pentosaceusxa0strainxa0PP49)的培养悬浮液可以抑制发光杆菌Pdp的生长速度;而且以发光杆菌Pdp攻毒后,喂食该菌株的鱼的相对存活率较对照组高出60%;此外,喂食本发明菌株的鱼,其吞噬细胞分解病原体的能力(respiratoryxa0burst)明显比对照组的吞噬细胞的高;因此,本发明的乳酸戊糖片球菌株PP49(P.pentosaceusxa0strainxa0PP49)可作为益生菌,帮助鱼抵抗发光杆菌。xa04.本发明所提供的含乳酸戊糖片球菌株PP49的饲料,经与Pdp死毒疫苗搭配使用后,可增强海鲡或其它鱼类对抗发光杆菌的免疫能力,且其效果相较于单独使用疫苗的鱼,喂食该饲料及搭配疫苗接种的鱼其相对存活率大幅提高。xa0上述详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明,但这些实施例并非用于限制本发明的专利范围,凡未脱离本发明技术精神所做的等效实施或变更,均应包含于本申请的专利范围中。xa0综上所述,本申请提供的乳酸菌株不但为新颖菌株,而且具有上xa0述多种功效,应已充分符合新颖性及创造性的法定发明专利要件,现依法提出申请,恳请贵局核准本发明专利申请,以励发明,至感德便。xa0序列表ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="430"/>ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="419"/>ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>